原理：

3-氨基邻苯二甲酰肼是一种较强的化学发光物质，在存在辣根过氧化酶催化的条件下，可以被氧分子氧化成具有发光现象的中间体，当中间体从激发态衰变到基态时可以产生明亮的化学荧光，常用于检测固定在膜上的蛋白质等生物大分子。其高灵敏度能够检测pg级别的抗原，发光信号强烈持久，可以使用照相技术（X-光胶片曝光）或者其他成像方法检测。

操作步骤：

1、常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。

2、洗涤膜上的HRP标记二抗时，新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液A和B混合，放置使之升到室温，否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。

3、用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触(约0.125ml /cm2膜)。室温孵育3-5分钟，准备立即压片曝光。孵育时间过长不会增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显降低灵敏度。为达节约目的可将膜剪小，但勿降低发光液用量。

4、用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。

5、在X光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内，最好蛋白带面向上。

6、在黑暗中放入X光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟。显影冲洗。